Διήθηση εφαπτομενικής ροής TFF σε συνδυασμό με υπερφυγοκέντρηση για αποτελεσματική προετοιμασία μικρών εξωκυτταρικών κυστιδίων

Τα μικρά εξωκυτταρικά κυστίδια (sEVs) είναι κυστίδια νανοκλίμακας που εκκρίνονται από κύτταρα που περιέχουν νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες, μικρά μόρια και άλλα συστατικά και παίζουν σημαντικό ρόλο στη διακυτταρική επικοινωνία. Τα μικρά εξωκυτταρικά κυστίδια-τύπου εξωσώματος μοιράζονται υψηλές ομοιότητες με τα μητρικά τους κύτταρα. Σε σύγκριση με τα τεχνητά νανοσωματίδια, παρουσιάζουν χαμηλότερους ρυθμούς κάθαρσης του ανοσοποιητικού και χαμηλότερη κυτταροτοξικότητα, καθιστώντας τα πολλά υποσχόμενα υποψήφια ως νέαin vivo οχήματα χορήγησης φαρμάκων. Σχεδόν όλοι οι τύποι κυττάρων μπορούν να εκκρίνουν αυτά τα κυστίδια και η έρευνα για την εφαρμογή τους ως φορείς φαρμάκων μετακινείται σταδιακά από το εργαστήριο προς τις κλινικές εφαρμογές. Ωστόσο,Η παραγωγή μεγάλης-κλίμακας παραμένει ένα σημαντικό εμπόδιο.

 

Τρέχουσες μέθοδοι για την απομόνωση εξωκυτταρικών κυστιδίων

Οι τρέχουσες μέθοδοι απομόνωσης εξωκυτταρικών κυστιδίων περιλαμβάνουνυπερφυγοκέντρηση, φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας, χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους-(SEC) και κατακρήμνιση πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG).

Η κατακρήμνιση PEG προσφέρει υψηλή απόδοση και απλή λειτουργία, αλλά σχετίζεται με σημαντική μόλυνση από ανεπιθύμητες πρωτεΐνες. Η φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας και η χρωματογραφία αποκλεισμού-μεγέθους μπορούν να παρέχουν προϊόντα υψηλής-καθαρότητας, αλλά η απόδοσή τους είναι σχετικά χαμηλή και οι διαδικασίες είναι- χρονοβόρες. Η υπερφυγοκέντρηση χρησιμοποιείται ευρέως, αλλά ο όγκος επεξεργασίας της περιορίζεται από τη χωρητικότητα της φυγοκέντρησης, γεγονός που καθιστά δύσκολη την κλιμάκωση.

 

Εφαρμογή Διήθησης Εφαπτομενικής Ροής για Διαχωρισμό sEV

Η διήθηση εφαπτομενικής ροής (TFF) έχει ήδη εφαρμοστεί στον διαχωρισμό νανοσωματιδίων όπως τα λιποσώματα και οι φακοϊικοί φορείς. Στο TFF, η τροφοδοσία ρέει εφαπτομενικά στην επιφάνεια της μεμβράνης, γεγονός που βοηθά στη μείωση της ρύπανσης της μεμβράνης και διευκολύνει την κλιμάκωση της διαδικασίας.

Δεδομένου ότι τα μικρά εξωκυτταρικά κυστίδια κυμαίνονται γενικά από30–200 nmσε διάμετρο, αΚασέτα μεμβράνης 0,45 μmμπορεί να επιλεγεί στο σύστημα TFF για την αφαίρεση μεγαλύτερων πρωτεϊνών και κυστιδίων, ενώ αΚασέτα μεμβράνης 300 kDaμπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αφαίρεση πρωτεϊνών μικρού μοριακού-βάρους και τη συμπύκνωση των μικρών εξωκυτταρικών κυστιδίων που υπάρχουν στο μέσο καλλιέργειας.

 

Χαρακτηρισμός της πρώτης ύλης μετά τον διαχωρισμό TFF

Η ανάλυση παρακολούθησης νανοσωματιδίων (NTA) έδειξε ότι οι διάμετροι των σωματιδίων κατανέμονταν κυρίως εντός του εύρους0–250 nm.

 

 

Ωστόσο, το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) αποκάλυψε μεγάλη ποσότητα μολυσματικής πρωτεΐνης, ενώ δεν παρατηρήθηκαν εξωκυτταρικά κυστίδια. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι απαιτείται ένα επιπλέον στάδιο καθαρισμού προς τα κάτω για τον περαιτέρω καθαρισμό των εξωκυτταρικών κυστιδίων.

 

Χαρακτηρισμός του συμπυκνώματος TFF μετά από υπερδιήθηση 100 kDa

Το συμπύκνωμα TFF υποβλήθηκε σε περαιτέρω επεξεργασία χρησιμοποιώντας αΣωλήνας υπερδιήθησης 100 kDa.

Το NTA έδειξε ότι οι διάμετροι σωματιδίων στα συμπυκνώματα που ελήφθησαν μετά από έναν και δύο γύρους υπερδιήθησης παρέμειναν κυρίως εντός του εύρους0–250 nm. Ωστόσο, η διεξαγωγή υπερδιήθησης δύο φορές είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση του αριθμού των σωματιδίων που ελήφθησαν.

Η ανάλυση TEM έδειξε ότι δεν παρατηρήθηκαν δομές-όμοιες με κυστίδια ούτε στα συμπυκνώματα υπερδιήθησης μίας-και δύο-χρόνων, ενώ παρέμεινε σημαντική ποσότητα μολυσματικής πρωτεΐνης.

Επομένως,Η υπερδιήθηση 100 kDa δεν μπορούσε να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά για τον καθαρισμό του μέσου καλλιέργειας μετά τη συγκέντρωση TFF.

 

 

Χαρακτηρισμός του συμπυκνώματος TFF που καθαρίστηκε με υπερφυγοκέντρηση

Το NTA έδειξε ότι οι διάμετροι σωματιδίων των καθαρισμένων προϊόντων κατανεμήθηκαν κυρίως εντός του εύρους των0–250 nm.

Είναι σημαντικό ότι το TEM αποκάλυψε ξεκάθαρα δομές που μοιάζουν με κυστίδια-σε διαφορετικά οπτικά πεδία. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά τη συμπύκνωση του μέσου καλλιέργειας χρησιμοποιώντας TFF,μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί υπερφυγοκέντρηση για περαιτέρω διαχωρισμό και καθαρισμό εξωκυτταρικών κυστιδίων.

 

 

Χαρακτηρισμός sEVs που απομονώθηκαν από ρυθμισμένο μέσο μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων με χρήση TFF σε συνδυασμό με υπερφυγοκέντρηση

Το NTA έδειξε ότι οι διάμετροι σωματιδίων των καθαρισμένων προϊόντων κατανεμήθηκαν κυρίως εντός του εύρους των0–250 nm.

Δομές που μοιάζουν με κυστίδια-παρατηρήθηκαν από το TEM. Η ανάλυση Western blot έδειξε θετική έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το εξωκυτταρικό κυστίδιο-CD9, CD63 και ALIXστα καθαρισμένα εξωκυτταρικά κυστίδια.

Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι τα καθαρισμένα μικρά εξωκυτταρικά κυστίδια περιείχαν εξωσώματα, υποδεικνύοντας ότι αυτή η μέθοδος μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί γιααπομόνωση και εξαγωγή εξωσώματος.

 

 

Συμπέρασμα: TFF σε συνδυασμό με υπερφυγοκέντρηση για υψηλή-Ποιότητα προετοιμασία sEV

Η μελέτη έδειξε ότιΜόνο συγκέντρωση TFFοδήγησε σε ένα προϊόν που περιείχε σημαντική ποσότητα μολυσματικών πρωτεϊνών και ως εκ τούτου ήταν ανεπαρκές για τη λήψη ειδικών εξωκυτταρικών κυστιδίων.

Ομοίως, χρησιμοποιώντας αΣωλήνας υπερδιήθησης 100 kDa για δευτερογενή καθαρισμόδεν απέδωσε αποτελεσματικά ανέπαφες δομές κυστιδίων.

Συνδυάζοντας τη συγκέντρωση TFF με τον επακόλουθο καθαρισμό με υπερφυγοκέντρηση, τα πλεονεκτήματα και των δύο τεχνικών μπορούν να ενσωματωθούν για να ληφθούνυψηλής ποιότητας-μικρά εξωκυτταρικά κυστίδια.

Σε σύγκριση με τη συμβατική υπερφυγοκέντρηση μόνο, η συνδυασμένη διαδικασία μπορεί αποτελεσματικάμείωση του συνολικού χρόνου επεξεργασίας και βελτίωση της αποτελεσματικότητας διαχωρισμού.

Σε αυτή τη ροή εργασίας,Το TFF επιτρέπει τον γρήγορο εμπλουτισμό δειγμάτων-μεγάλου όγκου, αντιμετώπιση του περιορισμού της συμβατικής υπερφυγοκέντρησης στην επεξεργασία μεγάλων όγκων δειγμάτων. Στη συνέχεια, η υπερφυγοκέντρηση εκτελεί βαθύ καθαρισμό για την απομάκρυνση των συν-συγκεντρωμένων ακαθαρσιών πρωτεϊνών ενώ βοηθά στη διατήρηση της καθαρότητας και της ακεραιότητας των κυστιδίων.

Επιπλέον, η διαδικασία δεν απαιτεί την προσθήκηεξωγενή χημικά αντιδραστήρια καθίζησης, βοηθώντας στη διατήρηση της βιολογικής δραστηριότητας των κυστιδίων στο μέγιστο δυνατό βαθμό.

Από την άποψη της βιομηχανικής μετάφρασης, αυτή η διαδικασία έχει σημαντικήκλιμακώστε-το δυναμικόκαι μπορεί να βοηθήσει στην αντιμετώπιση των προκλήσεων που σχετίζονται με τη-παραγωγή μεγάλης κλίμακας εξωκυτταρικών κυστιδίων γιαπαράδοση φαρμάκων, αναγεννητική ιατρική και ανάπτυξη σχετικών προϊόντων. Παρέχει επίσης μια σταθερή πειραματική βάση για επακόλουθη βελτιστοποίηση διεργασιών και πιλοτική-κατασκευή κλίμακας.

 

Αναφορά

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Καθιέρωση Μεθόδου Διαχωρισμού Μικρών Εξωκυτταρικών Κυστιδίων με Διήθηση Εφαπτομενικής Ροής σε συνδυασμό με Υπερφυγοκέντρηση. Κινεζική Εφημερίδα Βιολογικών, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.