Πρόσφατες εξελίξεις στις μεμβράνες αφαίρεσης ιών για καθαρισμό αντισωμάτων

Οι ιοί είναι μικροσκοπικά παρασιτικά σωματίδια που υπάρχουν στο περιβάλλον-συμπεριλαμβανομένου του νερού, του αέρα, του εδάφους-και εντός ζωντανών οργανισμών. Είναι υπεύθυνοι για ένα ευρύ φάσμα μολυσματικών ασθενειών και προκαλούν χιλιάδες θανάτους παγκοσμίως κάθε χρόνο. Λόγω του μικρού τους μεγέθους (20–200 nm), της αξιοσημείωτης περιβαλλοντικής σταθερότητας, της χαμηλής μολυσματικής δόσης και της πιθανότητας μετάδοσης σε μακρινές αποστάσεις, οι ιοί παρουσιάζουν σημαντικό κίνδυνο βιοασφάλειας.

Για να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος μόλυνσης από ιούς στα βιοφαρμακευτικά προϊόντα, είναι απαραίτητο να καθιερωθούν ισχυρές, αποτελεσματικές και αξιόπιστες στρατηγικές εκκαθάρισης του ιού σε όλη τη διαδικασία παραγωγής.

Οι συμβατικές μέθοδοι απενεργοποίησης και αφαίρεσης του ιού περιλαμβάνουν επώαση με χαμηλό{{0}pH, επεξεργασία με διαλύτη/απορρυπαντικό (S/D), ακτινοβόληση και διήθηση με μεμβράνη. Ωστόσο, κάθε τεχνική έχει εγγενείς περιορισμούς. Η επεξεργασία χαμηλού pH μπορεί να θέσει σε κίνδυνο τη σταθερότητα των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, ενώ η επεξεργασία με διαλύτες/απορρυπαντικά είναι αποτελεσματική μόνο έναντι των ιών με περίβλημα και παρέχει περιορισμένη προστασία έναντι των μη{4}}ιών. Ομοίως, η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) και η ακτινοβολία γάμμα ( ) μπορεί να βλάψουν κύτταρα, πρωτεΐνες ή άλλες βιολογικά δραστικές ουσίες.

 

Μεταξύ των σημερινών τεχνολογιών εκκαθάρισης ιών, η διήθηση μεμβράνης έχει αναδειχθεί ως μία από τις πιο υποσχόμενες προσεγγίσεις. Αφαιρεί αποτελεσματικά τους ιούς σε ένα ευρύ φάσμα μεγεθών, ενώ διατηρεί εξαιρετική ανοχή σε διάφορες φυσικές και χημικές συνθήκες επεξεργασίας. Η νανοδιήθηση έχει γίνει ένα τυπικό βήμα αφαίρεσης ιών στην παραγωγή προϊόντων που προέρχονται από πλάσμα, ιδιαίτερα για μικρούς ιούς όπως ο παρβοϊός Β19. Αυτή η τεχνολογία έχει επιδείξει υψηλή αποτελεσματικότητα αφαίρεσης έναντι πολλών ιών μοντέλων, συμπεριλαμβανομένου του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV), του ιού της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών (BVDV), του ιού της ψευδοορβίας (PRV), του παρβοϊού του σκύλου (CPV), του ιού της εγκεφαλομυοκαρδίτιδας (EMCV) και του ιού της ηπατίτιδας Α (HAV).

Αυτή η ανασκόπηση συνοψίζει την τρέχουσα κατανόηση των μηχανισμών διήθησης ιών, τις πρόσφατες εξελίξεις στα υλικά μεμβράνης αφαίρεσης ιών και τις κύριες προκλήσεις και τις μελλοντικές προοπτικές των τεχνολογιών διήθησης ιών με βάση τη μεμβράνη- στον καθαρισμό αντισωμάτων.

 

 

 

1. Μηχανισμοί Διαχωρισμού Μεμβρανών Απομάκρυνσης Ιού

Η απόδοση των μεμβρανών απομάκρυνσης του ιού διέπεται από τη σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ του μεγέθους των πόρων της μεμβράνης, των ιδιοτήτων της επιφάνειας και των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων με τα ιικά σωματίδια. Ενσωματώνοντας μηχανισμούς αποκλεισμού μεγέθους, ηλεκτροστατικής απώθησης και προσρόφησης, οι μεμβράνες απομάκρυνσης του ιού συλλαμβάνουν αποτελεσματικά και διατηρούν ιικούς μολυντές ενώ επιτρέπουν στα βιομόρια-στόχους να περάσουν.

1.1 Εξαίρεση μεγέθους

Ο αποκλεισμός μεγεθών είναι ένας από τους πιο ευρέως διαδεδομένους μηχανισμούς για την απομάκρυνση του ιού λόγω της υψηλής εκλεκτικότητας και της αποτελεσματικότητάς του φιλτραρίσματος (Εικόνα 1).

Με τον προσεκτικό έλεγχο του μεγέθους των πόρων της μεμβράνης, οι ιοί διαφορετικών διαστάσεων μπορούν να διαχωριστούν αποτελεσματικά, διασφαλίζοντας έτσι υψηλή καθαρότητα του προϊόντος. Επιπλέον, αυτός ο μηχανισμός δεν απαιτεί την προσθήκη χημικών αντιδραστηρίων, εξαλείφοντας τον κίνδυνο χημικής μόλυνσης ή υπολειμματικών ακαθαρσιών στο τελικό προϊόν.

Αυτά τα πλεονεκτήματα καθιστούν τον αποκλεισμό μεγέθους ιδανική στρατηγική αφαίρεσης ιών για βιοφαρμακευτική παραγωγή, ιδιαίτερα στην παραγωγή θεραπευτικών πρωτεϊνών, μονοκλωνικών αντισωμάτων, εμβολίων και άλλων βιολογικών προϊόντων.

Εικόνα 1. Αφαίρεση ιού με μηχανισμό αποκλεισμού μεγέθους

 

1.2 Ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση

Η ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση αντιπροσωπεύει έναν άλλο σημαντικό μηχανισμό διαχωρισμού του ιού και έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη σύλληψη και την απομάκρυνση του ιού (Εικόνα 2).

Αυτή η προσέγγιση εκμεταλλεύεται τις διαφορές στις δυνάμεις προσρόφησης μεταξύ των υλικών της μεμβράνης και των σωματιδίων του ιού. Προσαρμόζοντας τις ιδιότητες της επιφάνειας της μεμβράνης, οι ιοί μπορούν να συλληφθούν αποτελεσματικά μέσω της ηλεκτροστατικής έλξης.

Τα τυπικά υλικά ηλεκτροστατικής διήθησης περιλαμβάνουν νανοϊνώδεις μεμβράνες, πορώδη υλικά και λειτουργικά νανοϋλικά. Λόγω της μεγάλης ειδικής επιφάνειας και των άφθονων λειτουργικών ομάδων τους, αυτά τα υλικά παρέχουν πολυάριθμες ενεργές θέσεις δέσμευσης που ενισχύουν τις αλληλεπιδράσεις με τα ιικά σωματίδια και βελτιώνουν την κατακράτηση του ιού.

 

Μελέτες έχουν δείξει ότι διάφορες συνθήκες λειτουργίας επηρεάζουν σημαντικά την απόδοση απομάκρυνσης του ηλεκτροστατικού ιού:

1. Το χαμηλό pH και η χαμηλή ιοντική ισχύς μεγιστοποιούν την κατακράτηση του ιού ενισχύοντας τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της επιφάνειας της μεμβράνης και των ιικών σωματιδίων.

2. Δισθενή κατιόντα, όπως Mg2+ και Ca2+, μπορούν να μειώσουν την αποτελεσματικότητα απομάκρυνσης του ιού εξασθενώντας τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις.

3. Κατά τη διάρκεια της διακοπής της ροής, η κατακράτηση του ιού εξαρτάται κυρίως από την ηλεκτροστατική έλξη και την υδρόφοβη προσρόφηση μεταξύ της μεμβράνης και του βακτηριοφάγου PP7. Κάτω από αυτές τις συνθήκες, οι μεμβράνες απομάκρυνσης του ιού με χαμηλή συγγένεια πρωτεΐνης γενικά παρουσιάζουν χαμηλότερη απόδοση μείωσης καταγραφής (LRV).

Εικόνα 2. Μηχανισμός ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης στη διήθηση ιών

Με την ταχεία ανάπτυξη της βιοφαρμακευτικής βιομηχανίας, η διήθηση του ιού έχει γίνει ένα όλο και πιο κρίσιμο βήμα στον καθαρισμό και την παραγωγή βιολογικών ουσιών. Ωστόσο, οι συμβατικές μεμβράνες διήθησης ιών περιορίζονται συχνά από ανεπαρκή ροή διηθήματος, ανεπαρκή μακροπρόθεσμη σταθερότητα και υψηλή ευαισθησία στη ρύπανση της μεμβράνης, τα οποία μπορούν να θέσουν σε κίνδυνο την απόδοση της διαδικασίας και την απόδοση του προϊόντος.

Για την αντιμετώπιση αυτών των προκλήσεων, οι ερευνητές έχουν αφιερώσει σημαντικές προσπάθειες για την ανάπτυξη υλικών μεμβρανών επόμενης-γενιάς με βελτιωμένη απόδοση φιλτραρίσματος, βελτιωμένη αντίσταση ρύπανσης και ανώτερη λειτουργική σταθερότητα.

Οι πρόσφατες εξελίξεις περιλαμβάνουν:

1. Μεμβράνες υπερδιήθησης εμβολιασμένες με Zwitteronic SPP{1} (PES), οι οποίες βελτιώνουν την υδροφιλία της μεμβράνης και μειώνουν την απορρόφηση πρωτεϊνών.

2. Μικροπορώδεις μεμβράνες PES εμβολιασμένες με βούρτσες αμφιτεριονικού πολυμερούς, παρέχοντας βελτιωμένη αντιρρυπαντική απόδοση διατηρώντας παράλληλα υψηλή κατακράτηση ιών.

3. Μεμβράνες μικροδιήθησης με βάση-κυτταρίνη PAN/PET, που προσφέρουν εξαιρετική μηχανική αντοχή και απόδοση φιλτραρίσματος.

4. Θετικά φορτισμένες μεμβράνες πολυβινυλικής αλκοόλης (PVA) που κατασκευάζονται μέσω ηλεκτροϊνοποίησης και in situ φωτοδιασταύρωσης, οι οποίες ενισχύουν τη σύλληψη του ιού μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων.

5. Μεμβράνες νανοκαναλιών με στρώσεις κατασκευασμένες από νανοδομημένα υλικά υγρών κρυστάλλων (LC) που έχουν συναρμολογηθεί μόνος τους, που αντιπροσωπεύουν μια αναδυόμενη πλατφόρμα μεμβράνης με εξαιρετικά ελεγχόμενη αρχιτεκτονική πόρων και πολλά υποσχόμενη ικανότητα αφαίρεσης ιών.

Η συνεχής ανάπτυξη αυτών των προηγμένων υλικών μεμβράνης αναμένεται να βελτιώσει σημαντικά την απόδοση φιλτραρίσματος ιών, ενώ θα ξεπεράσει τους περιορισμούς των συμβατικών μέσων διήθησης.

 

3. Εμπορικά φίλτρα ιών

Τα εμπορικά φίλτρα ιών είναι γενικά διαθέσιμα σε δύο κύριες διαμορφώσεις:

* Μονάδες μεμβράνης κοίλων ινών

* Επίπεδες-κασέτες μεμβράνης

Αυτά τα φίλτρα συνήθως κατασκευάζονται από πολυμερή όπως:

* Υδρόφιλο φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF)

* Υδρόφιλη πολυαιθεροσουλφόνη (PES)

* Αναγεννημένη κυτταρίνη (RC)

Σε αντίθεση με τη φυσικά υδρόφιλη αναγεννημένη κυτταρίνη, το PVDF και το PES είναι εγγενώς υδρόφοβα υλικά. Κατά τη διάρκεια της διήθησης μεμβράνης, οι υδρόφοβες επιφάνειες τείνουν να προσροφούν πρωτεΐνες, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε απόφραξη πόρων, ρύπανση της μεμβράνης, μειωμένη ροή διηθήματος και τελικά χαμηλότερη ανάκτηση του προϊόντος.

Τα κύρια ρυπαντικά που συναντώνται κατά τη διήθηση του ιού περιλαμβάνουν συσσωματώματα πρωτεϊνών, υπολειμματικό DNA, μερικώς μετουσιωμένες πρωτεΐνες και άλλες ακαθαρσίες που σχετίζονται με τη διαδικασία-. Η ρύπανση όχι μόνο μειώνει την απόδοση καθαρισμού αλλά μπορεί επίσης να επηρεάσει αρνητικά την ποιότητα του τελικού προϊόντος. Κατά συνέπεια, η ενσωμάτωση ενός κατάλληλου σταδίου προδιήθησης είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την ελαχιστοποίηση της ρύπανσης της μεμβράνης και την παράταση της διάρκειας ζωής του φίλτρου.

Αν και πολλά φίλτρα ιών κοίλης ίνας είναι τεχνικά ικανά να λειτουργούν σε λειτουργία φιλτραρίσματος εφαπτομενικής ροής (TFF), οι περισσότερες εμπορικές διεργασίες φιλτραρίσματος ιών εκτελούνται επί του παρόντος υπό συνθήκες Dead-End Filtration (DFF).

Ο ιός λεπτών ποντικών (MVM) αναγνωρίζεται ευρέως ως ένας από τους πιο απαιτητικούς ιούς μοντέλων για την επικύρωση της απόδοσης αφαίρεσης ιών. Κατά συνέπεια, η βιοφαρμακευτική βιομηχανία έχει υιοθετήσει ευρέως φίλτρα συγκράτησης ιών 20 nm ως πρότυπο για την επικύρωση εκκαθάρισης ιών, αντικαθιστώντας τα φίλτρα με μεγαλύτερα μεγέθη πόρων.

 

4. Συμπέρασμα

Παρά τη σημαντική πρόοδο στον σχεδιασμό και τις τεχνολογίες κατασκευής μεμβρανών, η επίτευξη σταθερά υψηλής απόδοσης αφαίρεσης ιών παραμένει μια σημαντική πρόκληση.

Αν και η βελτιστοποίηση της δομής των πόρων της μεμβράνης και των ιδιοτήτων του υλικού έχει βελτιώσει την απόδοση του φιλτραρίσματος, οι υπάρχουσες τεχνολογίες εξακολουθούν να αντιμετωπίζουν περιορισμούς κατά την αφαίρεση διαφόρων ειδών ιών, ιδιαίτερα μικρών ή δομικά μοναδικών ιών. Ένας μοναδικός μηχανισμός αποκλεισμού φυσικού μεγέθους- δεν επαρκεί για την αντιμετώπιση όλων των απαιτήσεων αφαίρεσης ιών. Επομένως, η ενσωμάτωση πολλαπλών μηχανισμών διαχωρισμού-συμπεριλαμβανομένης της ηλεκτροστατικής προσρόφησης, της λειτουργικότητας της επιφάνειας και της χημικής τροποποίησης-θα είναι απαραίτητη για τη βελτίωση της συνολικής απόδοσης εκκαθάρισης του ιού.

Για τις διαδικασίες καθαρισμού αντισωμάτων, οι τρέχουσες μεμβράνες απομάκρυνσης του ιού συνεχίζουν να αντιμετωπίζουν προκλήσεις που σχετίζονται με την απόδοση της μεμβράνης, την αντίσταση στη ρύπανση και την αποτελεσματικότητα συγκράτησης του ιού. Η μελλοντική έρευνα θα πρέπει να επικεντρωθεί σε καινοτόμα υλικά μεμβράνης, προηγμένες τεχνολογίες τροποποίησης επιφάνειας και βελτιστοποιημένο σχεδιασμό διεργασιών για περαιτέρω βελτίωση της απόδοσης της μεμβράνης και ικανοποίηση των ολοένα και πιο αυστηρών ποιοτικών απαιτήσεων της σύγχρονης βιοφαρμακευτικής παραγωγής.

 

Αναφορές

Luo, X., Ye, H., Li, Η., *et al.* Πρόσφατες εξελίξεις στην εφαρμογή μεμβρανών αφαίρεσης ιών για διεργασίες καθαρισμού αντισωμάτων. *Shandong Chemical Industry*, 2024, 53(19): 153–157. DOI: 10.19319/j.cnki.issn.1008-021X.2024.19.048.